離心分離方法介紹

一）差速離心法
　　它利用不同的粒子在離心力場中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對離心力，使一個非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。操作過程中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開，然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復加高轉(zhuǎn)速，逐級分離出所需要的物質(zhì)。
　　差速離心的分辨率不高，沉淀系數(shù)在同一個數(shù)量級內(nèi)的各種粒子不容易分開，常用于其他分離手段之前的粗制品提取。
　　（二）速率區(qū)帶離心法
　　速率區(qū)帶離心法是在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心。離心后在近旋轉(zhuǎn)軸處（X1）的介質(zhì)密度最小，離旋轉(zhuǎn)軸最遠處（X2）介質(zhì)的密度最大，但最大介質(zhì)密度必須小于樣品中粒子的最小密度，即ρP＞ρm。這種方法是根據(jù)分離的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內(nèi)分成一系列區(qū)帶，達到彼此分離的目的。梯度液在離心過程中以及離心完畢后，取樣時起著支持介質(zhì)和穩(wěn)定劑的作用，避免因機械振動而引起已分層的粒子再混合。
　　由于ρP＞ρm可知S＞0，因此該離心法的離心時間要嚴格控制，既有足夠的時間使各種粒子在介質(zhì)梯度中形成區(qū)帶，又要控制在任一粒子達到沉淀前。如果離心時間過長，所有的樣品可全部到達離心管底部；離心時間不足，樣品還沒有分離。由于此法是一種不完全的沉降，沉降受物質(zhì)本身大小的影響較大，一般是應用在物質(zhì)大小相異而密度相同的情況。常用的梯度液有Ficoll、Percoll及蔗糖。
　　（三）等密度離心法
　　等密度離心法是在離心前預先配制介質(zhì)的密度梯度，此種密度梯度液包含了被分離樣品中所有粒子的密度，待分離的樣品鋪在梯度液頂上或和梯度液先混合，離心開始后，當梯度液由于離心力的作用逐漸形成底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時原來分布均勻的粒子也發(fā)生重新分布。當管底介質(zhì)的密度大于粒子的密度，即ρm＞ρP時粒子上浮；在彎頂處ρP＞ρm時，則粒子沉降，最后粒子進入到一個它本身的密度位置即ρP＝ρm，此時dx/dt為零粒子不再移動，粒子形成純組份的區(qū)帶，與樣品粒子的密度有關(guān)，而與粒子的大小和其他參數(shù)無關(guān)，因此只要轉(zhuǎn)速、溫度不變，則延長離心時間也不能改變這些粒子的成帶位置。
　　此法一般應用于物質(zhì)的大小相近，而密度差異較大時。常用的梯度液是CsCl。
　　（四）梯度溶液的制備
　　⒈梯度材料的選擇原則作為一種理想的梯度材料應具備以下幾點：①與被分離的生物材料不發(fā)生反應即完全惰性，且易與所分離的生物粒子分開。②可達到要求的密度范圍，且在所要求的密度范圍內(nèi)，粘度低，滲透壓低，離子強度和pH變化較小。③不會對離心設(shè)備發(fā)生腐蝕作用。④容易純化，價格便宜或容易回收。⑤濃度便于測定，如具有折光率。⑥對于超速離心分析工作來說，它的物理性質(zhì)、熱力學性質(zhì)應該是已知的。這些條件是理想條件，完全符合每種性能的梯度材料幾乎是沒有的。下面介紹幾種基本上符合上述原則的梯度材料：①糖類：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原。②無機鹽類：CsCl（氯化銫）、RbCl（氯化銣）、NaCl、KBr等。③有機碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）等。④硅溶膠：如Percoll。⑤蛋白質(zhì)：如牛血清白蛋白。⑥重水。⑦非水溶性有機物：如氟代碳等。
　　⒉梯度材料的應用范圍
　　⑴蔗糖：水溶性大，性質(zhì)穩(wěn)定，滲透壓較高，其最高密度可達1.33g/ml，且由于價格低容易制備，是現(xiàn)在實驗室里常用于細胞器、病毒、RNA分離的梯度材料，但由于有較大的滲透壓，不宜用于細胞的分離。
　　⑵聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400也就是相對分子重量為400000，F(xiàn)icoll滲透壓低，但它的粘度卻特別高，為此常與泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分離各種細胞包括血細胞、成纖維細胞、腫瘤細胞、鼠肝細胞等。
　　⑶氯化銫：是一種離子性介質(zhì)、水溶性大，最高密度可達1.91g/ml。由于它是重金屬鹽類，在離心時形成的梯度有較好的分辨率，被廣泛地用于DNA、質(zhì)粒、病毒和脂蛋白的分離，但價格較貴。
　　⑷鹵化鹽類：KBr和NaCl可用于脂蛋白分離，KI和NaI可用于RNA分離，其分辨率高于銫鹽。NaCl梯度也可用于分離脂蛋白，NaI梯度可分離天然或變性的DNA。
　　⑸Percoll：是商品名，它是一種SiO2膠體外面包了一層聚乙烯吡咯酮（PVP），滲透壓低，它對生物材料的影響小，而且顆粒穩(wěn)定，在冷卻和凍融情況下還是穩(wěn)定的，其粘度高，且在酸性pH和高離子強度下不穩(wěn)定。它可用于細胞、細胞器和病毒的分離。

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