DNA重組實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)原理
DNA重組是將外源DNA與載體分子連接，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。常用的DNA連接酶是T4噬菌體DNA連接酶，它不但能使粘性末端的DNA分子連在一起，而且能使平末端的雙鏈DNA分子連接起來，但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。
如果是單酶切，為了防止載體本身的自身連接，可以用牛小腸堿性磷酸酶（CIP）處理，去掉酶切后5'端的磷酸。這樣做能有效防止質(zhì)粒的自身環(huán)化，降低轉(zhuǎn)化的背景，大大提高重組子的篩出效率。
連接反應(yīng)的溫度在37℃時(shí)有利于連接酶的活性，但是在這樣的溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。一般的連接條件是在12-16℃，反應(yīng)12-16小時(shí)（過夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到粘性末端短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。
連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，還須對轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行篩選鑒定，挑選出所需的重組質(zhì)粒。
儀器、材料與試劑
一、儀器
1．恒溫?fù)u床
2．恒溫水浴
3．恒溫培養(yǎng)箱
4．小型高速離心機(jī)
二、材料
1．氨芐青霉素
2． BamHI
3． HindIII
4． T4 DNA連接酶
5． pQE-31 和pUC18-CAT 質(zhì)粒
6．培養(yǎng)皿
7．接種針
8．金屬涂棒
9． 1.5mL 離心管
10．酒精燈
11．鑷子、滅菌牙簽等
三、試劑
DNA瓊脂糖膠純化試劑盒
實(shí)驗(yàn)步驟
一、質(zhì)粒DNA
提取的pQE-31和pUC18-CAT 質(zhì)粒。
二、制備重組DNA
1. 在滅菌的1.5mL 離心管中，加入pQE-31質(zhì)粒10mL（2mg／mL），2mL酶切緩沖液，1mL BamHI 和HindIII酶的混合液（各含10個(gè)單位），無菌雙蒸水7mL，至反應(yīng)混合物總體積為20mL，離心混勻，37℃反應(yīng)過夜。
2. 在另一無菌1.5mL 離心管中，加pUC18-CAT 質(zhì)粒20mL，加入3mL酶切反應(yīng)液，lmL BamHI和HindIII酶的混合液，無菌雙蒸水補(bǔ)到30mL，37℃反應(yīng)過夜。
3. 反應(yīng)完畢后取5mL pQE-31質(zhì)粒的酶切液做電泳分析，檢驗(yàn)酶切是否完全。酶切完全，進(jìn)行下一步。
4. 將酶切處理的后pQE-31和pUC18-CAT 質(zhì)粒，分別上樣跑瓊脂糖凝膠電泳（注意加DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)）。電泳結(jié)束后用DNA瓊脂糖膠純化試劑盒按照試劑盒說明書的方法回收DNA片段。前者回收的片段為3.5kb，后者為650bp。
5. 將回收的pQE-31載體質(zhì)粒均分為兩份，其中一份與酶切后回收的CAT片段混合，做連接；另一份不加CAT片段，做對照。操作如下：
在10mL DNA樣品中，加T4 DNA連接酶緩沖液1mL，T4 DNA連接酶1mL，14℃（室溫）過夜，然后做大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。
三、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
1. 制備的感受態(tài)細(xì)胞（-20℃保存的）。
2. 在100mL的融化后處于冰浴的感受態(tài)細(xì)胞中，加入10mL連接產(chǎn)物，混勻，冰上放置30分鐘，以后的操作參照實(shí)驗(yàn)一進(jìn)行。同時(shí)做未加CAT片段的空白pQE-31載體質(zhì)粒連接處理后的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的對照。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
過夜培養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)組和對照組的兩個(gè)培養(yǎng)皿上都可能會出現(xiàn)一些菌落。如果實(shí)驗(yàn)組的菌落數(shù)明顯多于對照組的菌落，則是好征兆，但實(shí)驗(yàn)組中出現(xiàn)的菌落是否含有所需的DNA重組子還須進(jìn)一步鑒定。

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